在細胞培養(yǎng)過程中，凡混入細胞培養(yǎng)環(huán)境中對細胞生存有害的成分和造成細胞不純的異物都應(yīng)視為細胞污染，輕則實驗結(jié)果出不來，重則禍及他人（實驗室），前期投入的人力、物力、財力和長期的堅持都付諸東流。細胞污染不能完全被消除，但能減少其發(fā)生的頻率和后果的嚴重性。
一旦發(fā)現(xiàn)有細胞污染，我們該做些什么？
一、判定細胞污染類并處理
常見的細胞污染細胞培養(yǎng)中最常見污染的是細菌、真菌、支原體和黑膠蟲污染，判斷細胞是否污染的一種簡單方法是觀察培養(yǎng)基。我們將簡要介紹幾種常見的細胞污染類型及處理方法。
01細菌污染
特征：
◆ 細菌污染時細胞培養(yǎng)基可能在4-6小時呈現(xiàn)混濁。
◆ 有時稍加震蕩，便會有很多混濁物漂起。
◆ 在顯微鏡下呈黑色細沙狀，或背景有大量黑點。
細菌污染可能造成細胞增殖緩慢或形態(tài)上的改變（多角、多核等），胞質(zhì)中產(chǎn)生空泡、細胞漂浮凋亡。
處理方法：
| 抗生素 | 作用對象 | 使用比例 | 儲存條件 |
| 卡那霉素溶液 | 細菌（如G+、G-、支原體） | 稀釋:1:100 | -20℃ |
| 硫酸慶大霉素溶液 | 細菌（如G+、G-、支原體） | 稀釋:1:1000 | AMB(15-30℃) |
| 青鏈雙抗 | 細菌（如G+、G-） | 稀釋:1:100 | -20℃ |
| 青鏈雙抗，10濃縮液 | 細菌（如G+、G-） | 稀釋:1:1000 | -20℃ |
| 青鏈霉素制霉菌素三抗 | 細菌（如G+、G-）、真菌（如：酵母菌、霉菌） | 稀釋:1:100 | -20℃ |
| 青鏈霉素兩性霉素B三抗 | 細菌（如G+、G-）、真菌（如：酵母菌、霉菌） | 稀釋:1:100 | -20℃ |
| 青鏈霉素，新霉素三抗 | 細菌（如G+、G-） | 稀釋:1:100 | -20℃ |
輕度細菌污染可用10X雙抗清洗處理，重度細菌污染建議消殺后丟棄。
02真菌污染
特征：◆ 真菌污染最短3天才能長出橢圓形的霉斑。◆ 霉斑往往會漂浮在培養(yǎng)液表面，隨著時間逐步擴大。
◆ 有些真菌呈類似棉花絮狀的漂浮物。
◆ 若是念珠菌會呈卵圓狀，在細胞周邊生長。
◆ 早期并不會使得培養(yǎng)基變黃變渾濁，但在顯微鏡下可觀察到菌絲體。真菌形成的菌絲呈絲狀，管狀，樹枝狀，串珠狀。
◆ 酵母菌等，當(dāng)其行出芽生殖時可從一大一小的連體結(jié)構(gòu)識別。
◆ 細胞被污染后，仍可生長，長時間細胞的活力狀態(tài)會變差。
◆ 梅雨季時的污染率會提高。
◆ 呈卵圓狀酵母菌增殖到一定規(guī)模，形成團簇狀的真菌群。
處理方法：
| 抗生素 | 作用對象 | 使用比例 | 儲存條件 |
| 兩性霉素B | 真菌（如：酵母菌、霉菌） | 稀釋:1:1000-1:10,000 | -20℃ |
| 制霉菌素 | 真菌（如：酵母菌、霉菌） | 稀釋:1:100-1:1000 | -20℃ |
| 青鏈霉素制霉菌素三抗 | 細菌（如G+、G-）、真菌（如：酵母菌、霉菌） | 稀釋: 1:100 | -20℃ |
| 青鏈霉素兩性霉素B三抗 | 細菌（如G+、G-）、真菌（如：酵母菌、霉菌） | 稀釋: 1:100 | -20℃ |
細胞真菌污染較難根除，不建議保留，建議消殺后丟棄。
03支原體污染
最小的微生物，無法通過光學(xué)顯微鏡看見，但可通過電鏡觀察到。
感染支原體的細胞，在某一時間點碎片突然增多，隨著傳代，細胞狀態(tài)顯著變差。
細胞支原體污染可通過氣溶膠傳播，影響同一細胞房其他細胞。
特征：
◆ 增殖減慢
◆ 上清液清澈
◆ 背景干凈
◆ 細胞形態(tài)異常（拉絲、鋪展）
◆ 更換新的培養(yǎng)液，細胞狀態(tài)沒有恢復(fù)
鑒定方法：
PCR法、顯色法、熒光染色法等。
示例1?EBTr (牛胚氣管細胞)
感染了支原體的EBTr特征：
1.由成纖維樣逐漸變得類上皮樣；
2.質(zhì)膜鋪展，潰爛；
3.輪廓不清，邊界模糊；
4.凋亡細胞過多。
示例2?HT1080 (人纖維肉瘤細胞)
感染了支原體的人纖維肉瘤細胞特征：
1.由上皮樣逐漸變得類成纖維樣，胞體細長；
2.偽足伸長，出現(xiàn)明顯的拉絲現(xiàn)象。
處理方法：
◆若細胞污染后狀態(tài)尚可，添加支原體抑制劑培養(yǎng)2-3代可轉(zhuǎn)陰
◆ 若細胞污染后狀態(tài)很差，建議消殺后丟棄。
04黑膠蟲污染
“黑膠蟲”可寄生于動物細胞，也可以生存于培養(yǎng)基中，依靠細胞和培養(yǎng)基中的營養(yǎng)為生，并隨細胞傳代而傳代，是一種異養(yǎng)生物。
特征：
鏡下無法直接觀察到。主要表現(xiàn)為細胞狀態(tài)差，黑點和碎片多，布朗運動。通過檢測發(fā)現(xiàn)主要為細胞支原體污染，部分為未知的增殖不明顯的微生物污染。
處理方式：
◆ 若細胞污染后狀態(tài)尚可，添加黑膠蟲抑制劑/支原體抑制劑培養(yǎng)2-3代可轉(zhuǎn)陰
◆ 若細胞污染后狀態(tài)很差，建議消殺后丟棄。
二、改善個人操作及培養(yǎng)環(huán)境
01清潔培養(yǎng)箱
發(fā)現(xiàn)細胞污染不能只處理這一個培養(yǎng)皿，還得看看這個恒溫培養(yǎng)箱里其他培養(yǎng)皿或孔板里的細胞是否污染。
如果有而且好幾個板子都有類似的污染塊，那很可能是培養(yǎng)箱中的水或者空氣污染了，得給培養(yǎng)箱做個大掃除，重新酒精消毒，照紫外；孵箱里的水，不僅沒了得加還得記得十天半個月的就用酒精擦擦托盤。
02整理潔凈臺
超凈臺不是儲物箱，什么培養(yǎng)皿、各種規(guī)格的板子、槍頭不要堆在超凈臺，會造成許多紫外線顧不到的衛(wèi)生死角。
細胞房其他的桌面，同樣切忌東西堆積如山，不要將酒精棉球、標(biāo)簽紙、牛皮紙買來后全部堆在細胞房，污染物一不小心“飄”進你的細胞培養(yǎng)板里，細胞就會死給你看！
03嚴格無菌操作
細胞房這種衛(wèi)生要求高的地方，人一旦多了救護增加許多不確定因素，難以保證試驗在無菌條件下操作。出入試驗室，實驗服當(dāng)風(fēng)衣穿，不扣紐扣，不戴鞋套，猶入無人之境，來去自由；超凈臺做實驗時，喜歡說話聊著做試驗，殊不知你噴口氣，里面就有很多細菌。
規(guī)范操作是避免污染的最有效方式。
細胞培養(yǎng)間配備槍式移液器、手術(shù)器械、離心機、冰箱等專用儀器設(shè)備以及專用的實驗服和拖鞋，并定期消毒。
專用物品只在培養(yǎng)間內(nèi)使用，不得帶出細胞房。無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞。必要物品可暫時放置，其他實驗用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流的通暢。
培養(yǎng)細胞過程中使用的所有實驗用具，如移液管、一次性槍頭、一次性塑料離心管、凍存管等需121°C高壓滅菌20分鐘后烤干備用，一些玻璃器皿如細胞培養(yǎng)瓶等須先泡酸、洗凈、晾干后再高壓滅菌。
